故事的主要背景是上海的一条普通小弄堂。钟伯（冯淬帆饰）和阿龙（张立饰）是食堂的常客，他们生活在弄堂中，每当夜幕降临，这个城市的孤独灵魂们就会在这里相遇。不仅如此，广告公司的加班三人组也常常光顾这家食堂，他们在美食中洗去了一天的疲劳，也结识了更多有故事的朋友。夜班出租车司机唐宋（魏晨饰）是其中之一，他是在接到醉酒的音乐人阿信（邓超饰）时第一次发现了这家食堂的存在。从此以后，他每天清晨都会带着青梅竹马的思思（张艺上饰）来品尝家乡的蛋饼。然而，唐宋渴望平静的生活，而思思却怀揣梦想。在这个机会繁多的大城市中，两个年轻人的人生是否会像蛋饼一样圆满？

深夜食堂也成为了许多人相遇、相知以及成长的地方。调香师小美（郑欣宜饰）喜欢在这里倾诉自己的喜怒哀乐，尤其是她与初恋学长的往事。在食客们的帮助下，小美渐渐释怀了这段遗憾的青春。而钟伯这位"老牌绅士"最终与菜场的海鲜老板莲婶（金燕玲饰）走到了一起。莲婶的儿子开源（杨祐宁饰）是个老实憨厚的人，在食堂偶遇了带着女儿来吃糖藕的单亲妈妈明月（刘涛饰），从此对她心生爱慕。此外，"海漂女孩"小雪（焦俊艳饰）的出现也让阿信终于找到了音乐路上的知音。

大叔的食堂见证了人来人往的故事，不论深夜多么寂静，路途多么遥远，他都会在这里继续倾听每一个人的故事，满足食客们的味蕾，就像这座城市的一颗温暖之心，永远敞开着等待着每一个渴望分享的人。